Evaluation of inhibitory action of standard antifungals and "Handroanthus impetiginosus" on kinetic of development of "Candida albicans" biofilm

Orientador: Marcelo Fabiano Gomes BoriolloTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar a cinética do desenvolvimento de biofilmes de "Candida albicans" em superfícies de corpos de prova, sob a influência de películas adsorvidas, e os efeitos anti-biofilme dos antifúngicos Anfotericina B (AB), Fluconazol (FLU) e Nistatina (NYS) e dos extratos hidroalcoólico (FEHi) e seco (DEHi) da casca de "Handroanthus impetiginosus" através de modelos de ensaios in vitro. As amostras foram submersas em sistemas de pré-condicionamento: PBS, saliva artificial (AS), soro fetal bovino (FBS) e AS + FBS (1: 1). As células planctônicas recém-cultivadas foram incubadas em placas de microdiluição, contendo as amostras e o meio apropriado, por 1½h (fase de adesão: PBS), 8h (fase inicial: YNB), 24h (fase intermediária: YNB) e 48h (fase de maturação: YNB). A concentração inibitória mínima do biofilme séssil (SMIC) foi realizada pelo método de microdiluição em caldo e a bioatividade nos biofilmes foi monitorada pelo ensaio XTT. A viabilidade celular, a biomassa relativa do biofilme (?m3) e a espessura do biofilme (µm) foram avaliadas por microscopia de varredura a laser confocal (CLSM). A morfologia ultraestrutural foi analisada por Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). Maiores bioatividades foram registradas na presença de SFB. Em média, os biofilmes tratados com FLU e AB foram parcialmente inibidos dependentemente da dose, enquanto que NYS inibiu completamente a partir de concentrações de 15,6 ou 62,5 µg/ml, conforme adoção de critérios. Os tratamentos com agentes antifúngicos (concentrações idênticas) não mostraram diferenças estatísticas aos parâmetros biológicos (células não viáveis) e de parâmetros de magnitude (biomassa e espessura relativa). Em média, FEHi mostrou inibição das atividades metabólicas ?100 mg/ml (maior ação em 1½h e 8h). SMIC80 de FEHi foi crescentemente elevada ao longo do desenvolvimento do biofilme. Em média, DEHi mostrou inibição parcial das atividades metabólicas (maior ação em 8h e 24h). SMIC80 de DEHi não foi observada nas concentrações testadas. FEHi e DEHi atuaram igualmente sobre os parâmetros biológico (percentual de células não viáveis) e de grandeza (biomassa relativa e espessura) dos biofilmes de "C. albicans". A espessura dos biofilmes foi maior na fase de maturação, enquanto que os percentuais de células não viáveis e biomassa relativa do biofilme foram invariáveis ao longo do desenvolvimento do biofilme. As ações de FEHi e DEHi produziram efeitos variáveis quanto ao dimorfismo, volume microbiano e densidade populacional microbiana, especialmente nas fases de adesão e inicial de desenvolvimento do biofilme de "C. albicans". As características morfológicas ultra estruturais são dependentes do extrato de "H. impetiginosus" e das fases de desenvolvimento dos biofilmes de "C. albicans", sugerindo diferenças na composição fitoquímica de ambos os extratos. Os dados sugerem que há redução parcial (FLU e AB) ou efetiva (NYS) da atividade metabólica da cinética de crescimento dos biofilmes de "C. albicans", dependendo do tempo e do antifúngico e suas concentrações. FEHi e DEHi apresentam efetividades dose-, superfície- e tempo-dependentes. Contudo, FEHi tem maior ação anti-biofilme, sugerindo sua potencial aplicação ao desenvolvimento de novos fármacos e produtos relacionadosAbstract: The aim of the present study was to evaluate the kinetics of "Candida albicans" biofilm development on specimen surfaces under the influence of adsorbed films, and the anti-biofilm effects of antifungals: Amphotericin B (AB), Fluconazole (FLU) and Nystatin (NYS) and hydroalcoholic (FEHi) and dry (DEHi) extracts of "Handroanthus impetiginosus" bark by in vitro test models. The samples were submerged in preconditioning systems: PBS, artificial saliva (AS), fetal bovine serum (FBS) and AS + FBS (1: 1). The newly cultivated planktonic cells were incubated in microdilution plates containing the samples and the appropriate medium for 1½h (adhesion phase: PBS), 8h (initial phase: YNB), 24h (intermediate phase: YNB) and 48h (phase maturation: YNB). The minimum inhibitory concentration of the sessile biofilm (SMIC) was performed by the broth microdilution method and the bioactivity in the biofilms was monitored by the XTT assay. Cell viability, relative biofilm biomass (?m3) and biofilm thickness (µm) were evaluated by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The ultrastructural morphology was analyzed by Scanning Electron Microscope (SEM). Higher bioactivities were recorded in the presence of FBS. On average, FLU and AB-treated biofilms were partially dose-dependent inhibited, whereas NYS inhibited completely from concentrations of 15.6 or 62.5 µg/ml, as criteria were adopted. Treatments with antifungal agents (identical concentrations) showed no statistical differences between biological parameters (non-viable cells) and magnitude parameters (biomass and relative thickness). On average, FEHi showed inhibition of metabolic activities ?100 mg / ml (highest action at 1½h and 8h). FEHi's SMIC80 was increasingly elevated throughout biofilm development. On average, DEHi showed partial inhibition of metabolic activities (highest action at 8h and 24h). DEHi SMIC80 was not observed at the concentrations tested. FEHi and DEHi also affected the biological (percentage of non-viable cells) and magnitude (relative biomass and thickness) parameters of "C. albicans" biofilms. The thickness of the biofilms was higher in the maturation phase, while the percentages of non-viable cells and relative biomass of the biofilm were invariable throughout the biofilm development. The actions of FEHi and DEHi produced variable effects on dimorphism, microbial volume and microbial population density, especially in the adhesion and early stages of development of "C. albicans" biofilm. The ultrastructural morphological characteristics are dependent on "H. impetiginosus" extract and on the developmental stages of "C. albicans" biofilms, suggesting differences in the phytochemical composition of both extracts. The data suggest that there is a partial (FLU and AB) or effective (NYS) reduction in the metabolic activity of "C. albicans" biofilm growth kinetics, depending on time and antifungal and their concentrations. FEHi and DEHi have dose-, surface- and time-dependent effectiveness. However, FEHi has greater anti-biofilm action, suggesting its potential application to the development of new drugs and related productsDoutoradoMicrobiologia e ImunologiaDoutor em Biologia Buco-DentalCAPE